Spektrofotometria je experimentálna technika používaná na meranie koncentrácie rozpustenej látky v konkrétnom roztoku výpočtom množstva svetla absorbovaného touto látkou. Táto technika je veľmi užitočná, pretože určité zlúčeniny budú tiež absorbovať rôzne vlnové dĺžky svetla pri rôznych intenzitách. Analýzou svetla prechádzajúceho roztokom môžete identifikovať zlúčeniny rozpustené v roztoku a ich koncentrácie. Laboratórnym nástrojom na analýzu roztokov touto technikou je spektrofotometer.
Krok
Časť 1 z 3: Príprava vzorky
Krok 1. Zapnite spektrofotometer
Väčšinu spektrofotometrov je potrebné pred presnými meraniami zahriať. Pred meraním vzorky teda spustite zariadenie a nechajte ho odstáť najmenej 15 minút.
Tento čas použite na prípravu vzorky
Krok 2. Vyčistite kyvetu alebo skúmavku
V školských laboratóriách môžu byť k dispozícii jednorazové skúmavky, ktoré sa nemusia najskôr čistiť. Ak však používate bežnú kyvetu alebo skúmavku, pred použitím prístroj dôkladne vyčistite. Všetky kyvety opláchnite deionizovanou vodou.
- Opatrne používajte kyvety, pretože sú dosť drahé.
- Pri použití kyvety sa nedotýkajte strany, kde prechádza svetlo (zvyčajne je to čistá strana nádoby).
Krok 3. Do kyvety nalejte dostatočné množstvo vzorky
Maximálny objem časti kyvety je 1 ml, zatiaľ čo maximálny objem skúmavky je 5 ml. Vaše merania by mali byť presné, pokiaľ svetlo spektrofotometra môže stále prechádzať vzorkou a nie prázdnou časťou nádoby.
Ak na vkladanie vzoriek používate pipetu, pre každú vzorku použite nový hrot. Tak sa dá vyhnúť krížovej kontaminácii
Krok 4. Pripravte kontrolný roztok
Tieto roztoky, ktoré sú tiež známe ako polotovary alebo polotovary, obsahujú v analyzovanom roztoku iba rozpúšťadlo. Ak máte napríklad vzorku soli rozpustenú vo vode, slepý roztok, ktorý potrebujete, je voda. Ak je voda, ktorú používate, červená, mali by ste použiť aj červený slepý roztok. Na podobnú nádobu použite slepý roztok v rovnakom objeme ako vo vzorke.
Krok 5. Utrite vonkajšiu stranu kyvety
Pred vložením kyvety do spektrofotometra sa musíte uistiť, že je čistá, aby nedošlo k rušeniu meraní v dôsledku častíc prachu alebo nečistôt. Pomocou handričky, ktorá nepúšťa vlákna, odstráňte všetky kvapôčky vody alebo prach, ktoré ulpievajú na vonkajšej strane kyvety.
Časť 2 z 3: Experimentovanie
Krok 1. Určte a upravte vlnovú dĺžku svetla na analýzu vzorky
Na zvýšenie účinnosti merania použite jednu vlnovú dĺžku svetla (monochromatický lúč). Vyberte farbu svetla, ktorú môže absorbovať chemický obsah, o ktorom sa predpokladá, že sa rozpustí v testovanej vzorke. Nastavte vlnovú dĺžku podľa špecifikácií spektrofotometra, ktorý používate.
- V školských laboratóriách budú tieto vlnové dĺžky zvyčajne uvedené v experimentálnych pokynoch.
- Pretože vzorka bude odrážať všetko viditeľné svetlo, vlnová dĺžka farby experimentálneho svetla sa zvyčajne vždy líši od farby vzorky.
- Objekt má určitú farbu, pretože odráža určitú vlnovú dĺžku a absorbuje všetky ostatné farby. Tráva vyzerá zelená, pretože chlorofyl v nej odráža zelenú a absorbuje iné farby.
Krok 2. Kalibrujte spektrofotometer slepým roztokom
Vložte slepý roztok do kyvetového držiaka a zatvorte spektrofotometer. Na obrazovke analógového spektrofotometra je ihla, ktorá sa bude pohybovať podľa intenzity detekcie svetla. Po vložení slepého roztoku by sa ihla mala posunúť doprava. Zaznamenajte si túto hodnotu pre prípad, že ju budete neskôr potrebovať. Nechajte slepý roztok zostať v spektrofotometri, potom posuňte ihlu na nulu pomocou nastavovacieho gombíka.
- Rovnakým spôsobom je možné kalibrovať aj digitálne spektrofotometre. Tento nástroj je však vybavený digitálnou obrazovkou. Otočným gombíkom nastavte hodnotu slepého roztoku na 0.
- Aj keď sa slepý roztok odstráni zo spektrofotometra, kalibrácia bude stále platná. Keď teda zmeriate celú vzorku, absorbancia slepého pokusu sa automaticky zníži.
Krok 3. Odstráňte slepý pokus a otestujte výsledky kalibrácie spektrofotometra
Aj po vybratí slepého roztoku zo spektrofotometra by mala ihla alebo číslo na obrazovke stále ukazovať 0. Vložte slepý roztok späť do spektrofotometra a uistite sa, že sa údaje nemenia. Ak je spektrofotometer správne kalibrovaný pomocou slepého roztoku, výsledok na obrazovke by mal byť stále 0.
- Ak ihla alebo číslo na obrazovke neukazuje 0, zopakujte kroky kalibrácie s prázdnym roztokom.
- Ak problém pretrváva, vyhľadajte pomoc alebo nechajte niekoho skontrolovať spektrofotometer.
Krok 4. Zmerajte absorbanciu vzorky
Odstráňte slepý roztok a vložte vzorku do spektrofotometra. Počkajte asi 10 sekúnd, kým sa ruky stabilizujú alebo sa čísla na digitálnom displeji prestanú meniť. Zaznamenajte percento priepustnosti a/alebo absorbancie vzorky.
- Čím viac svetla prejde, tým menej svetla pohltí. Obvykle musíte zaznamenať hodnotu absorbancie vzorky, ktorá je spravidla vyjadrená ako desatinné číslo, napríklad 0,43.
- Meranie každej vzorky zopakujte najmenej trikrát a potom vypočítajte priemer. Vďaka tomu budú výsledky, ktoré získate, presnejšie.
Krok 5. Experiment zopakujte s rôznymi vlnovými dĺžkami svetla
Vaša vzorka môže obsahovať niekoľko zlúčenín, ktoré majú rôzne absorbancie v závislosti od vlnovej dĺžky svetla. Aby sa znížila neistota, opakujte merania vzorky v intervaloch vlnových dĺžok 25 nm v celom svetelnom spektre. Týmto spôsobom môžete vo vzorke detegovať ďalšie rozpustené chemikálie.
Časť 3 z 3: Analýza údajov o absorpcii
Krok 1. Vypočítajte priepustnosť a absorbanciu vzorky
Priepustnosť je to, koľko svetla môže prejsť vzorkou a dosiahnuť spektrofotometer. Medzitým je absorbancia to, koľko svetla absorbuje jedna z rozpustených chemikálií vo vzorke. Existuje mnoho moderných spektrofotometrov, ktoré poskytujú výstup vo forme priepustnosti a absorbancie. Ak však získate hodnotu intenzity svetla, môžete si tieto dve hodnoty vypočítať aj sami.
- Priepustnosť (T) možno určiť vydelením intenzity svetla prechádzajúceho roztokom vzorky množstvom svetla prechádzajúceho slepým roztokom. Táto hodnota je zvyčajne vyjadrená ako desatinné číslo alebo percento. T = I/I0, kde I je intenzita vzorky a I0 je prázdna intenzita.
- Absorbancia (A) je vyjadrená ako negatívna báza 10 logaritmov (exponent) transmitancia: A = -log10T. Ak teda T = 0, 1, A = 1 (0, 1 je 10 až mocnina -1). To znamená, že prejde 10% svetla, zatiaľ čo 90% je absorbovaných. Medzitým, ak T = 0,01, A = 2 (0,01 je 10 až -2). To znamená, že svetlo, ktoré prechádza, je 0,1%.
Krok 2. Vytvorte graf hodnoty absorbancie vs. vlnovej dĺžky
Hodnotu absorbancie vyjadrite ako os y a vlnovú dĺžku ako os x. Z bodov všetkých výsledkov absorbancie v každej vlnovej dĺžke získate spektrum absorbancie vzorky a identifikujete obsah zlúčeniny a jej pomer vo vzorke.
Absorpčné spektrá majú zvyčajne píky pri určitých vlnových dĺžkach. Tieto špičkové vlnové dĺžky vám umožňujú identifikovať konkrétne zlúčeniny
Krok 3. Porovnajte svoje absorpčné spektrum s grafom známej zlúčeniny
Každá zlúčenina má jedinečné spektrum absorbancie a pri každom meraní má vždy rovnakú špičkovú vlnovú dĺžku. Porovnaním grafu, ktorý získate s grafom určitej známej zlúčeniny, môžete identifikovať obsah rozpustenej látky v roztoku vzorky.
