Gramové farbenie je rýchla technika a používa sa na zistenie prítomnosti baktérií vo vzorke tkaniva a na klasifikáciu baktérií ako grampozitívnych alebo gramnegatívnych na základe chemických a fyzikálnych vlastností ich bunkových stien. Gramovo farbenie sa takmer vždy používa ako prvý krok pri diagnostikovaní bakteriálnej infekcie.
Táto metóda farbenia je pomenovaná po dánskom vedcovi Hansovi Christianovi Gramovi (1853 - 1938), ktorý túto techniku vyvinul v roku 1882 a v roku 1884 ju publikoval ako techniku na rozlíšenie dvoch typov baktérií s podobnými klinickými príznakmi: Streptococcus pneumoniae (tiež známy ako Streptococcus pneumoniae). Pneumokoky) a baktéria Klebsiella pneumoniae.
Krok
Metóda 1 z 3: Príprava mikroskopického sklíčka
Krok 1. Pripravte sa na prácu v laboratóriu
Aby ste predišli bakteriálnej kontaminácii vzorky, ktorú testujete, noste rukavice a kravatu s dlhými vlasmi. Pracovný priestor vyčistite pod digestorom alebo na inom dobre vetranom mieste. Pred spustením skontrolujte Bunsenov horák a uistite sa, že mikroskop funguje správne.
Krok 2. Sterilizujte sklíčko mikroskopu
Ak je sklíčko znečistené, umyte ho mydlovou vodou, aby ste odstránili olej a nečistoty. Sklíčka očistite etanolom, čističom skla alebo iným spôsobom, ktorý používa vaše laboratórium.
Krok 3. Umiestnite vzorku na sklenené podložné sklíčko
Na identifikáciu baktérií v lekárskej vzorke alebo v kultúre baktérií rastúcich v Petriho miske môžete použiť techniku Gramovho farbenia. Najlepšie výsledky dosiahnete použitím Gramových škvŕn na tenké ťahy vzorky. Odporúča sa použiť vzorky, ktoré sú mladšie ako 24 hodín, pretože staršie baktérie môžu poškodiť bunkové steny a nemusia reagovať na Gramovo farbenie.
- Ak používate vzorku tkaniva, pridajte 1–2 kvapky na sklenené podložné sklíčko. Rovnomerne rozotrite na podložné sklíčko, aby sa vytvorila tenká vrstva postreku vzorky, a to tak, že ho posuniete okrajom druhého sterilného skleneného podložného sklíčka. Pred ďalším krokom nechajte uschnúť.
- Ak odoberáte baktérie z Petriho misky, sterilizujte očkovaciu slučku v Bunsenovom horáku, kým sa nerozžiari, potom nechajte vychladnúť. Pomocou slučky nakvapkajte na podložné sklíčko sterilnú vodu, potom sterilizujte a znova vychladnite a potom použite na odber malej vzorky baktérií. Potom jemne premiešajte.
- Baktérie pripravené v bujóne sa musia znova premiešať pomocou vortexu, potom sa odoberú očkovacou slučkou, ako je uvedené vyššie, bez pridania vody.
- Ak máte vzorku tampónu (zvyčajne sa robí malou rúčkou s bavlnenou špičkou), dotknite sa tampónu a jemne ním otáčajte cez podložné sklíčko.
Krok 4. Mierne vysoká teplota môže urobiť dobrý náter
Teplo drží baktérie na vrchu podložného sklíčka, takže sa počas farbenia nerozpúšťajú ľahko. Dvakrát až trikrát dvakrát rýchlo poklepte na sklíčko na Bunsenovom horáku alebo ho zohrejte na elektrickom ohrievači diapozitívov. Neprehrievajte, vzorka sa môže poškodiť. Ak používate horák Bunsen, namiesto veľkého oranžového plameňa by to mal byť malý, ale modrý plameň.
Alternatívne je možné náter natrieť aj metanolom, pridaním 1-2 kvapiek metanolu do suchého náteru a vysušením zvyšného metanolu na podložnom skle ponechaním na čerstvom vzduchu. Táto technika minimalizuje poškodenie buniek a poskytuje čisté pozadie snímky
Krok 5. Umiestnite sklíčko nad podnos na farbenie
Farbiace podnosy sú vyrobené z kovu, skla alebo plytkých plastových dosiek s vrchnou vrstvou z mäkkej sieťoviny. Položte podložné sklíčka na vrch týchto sietí, aby tekutina, ktorú použijete, mohla odtiecť do zásobníka.
Ak nemáte podnos na farbenie, môžete na plastový podnos položiť sklíčko na tlač kociek ľadu
Metóda 2 z 3: Proces Gramovho farbenia
Krok 1. Náter nalejte kryštálovofialovou kvapalinou
Pipetou nastriekajte vzorku baktérií niekoľkými kvapkami kryštálovofialového farbiva, známeho tiež ako enciánová fialová. Nechajte pôsobiť 30-60 sekúnd. Kryštálová fialová (KV) sa vo vodnom roztoku oddelí na ióny KV+ a chlorid (Cl-). Tieto ióny prenikajú do bunkových stien a bunkových membrán grampozitívnych aj gramnegatívnych baktérií. Ión KV+ interaguje s negatívne nabitými zložkami bakteriálnych buniek a dodáva bunkám purpurovú farbu.
Mnoho laboratórií používa kryštálovú fialku „Hucker“, ktorá obsahuje oxalát amónny, aby sa zabránilo vyzrážaniu
Krok 2. Kryštálovú fialku jemne opláchnite
Nakloňte sklíčko a pomocou fľaše s podložkou nastriekajte na sklíčko malý prúd destilovanej alebo vodovodnej vody. Voda by mala stiecť po povrchu náteru a nemala by byť striekaná priamo na náter. Neoplachujte nadmerne. Dokáže odstrániť zafarbenie grampozitívnych baktérií.
Krok 3. Náter opláchnite jódom a potom opláchnite
Pomocou kvapkadla opláchnite náter jódom. Nechajte pôsobiť najmenej 60 sekúnd, potom dôkladne opláchnite rovnakým spôsobom ako vyššie. Jód vo forme záporne nabitého iónu interaguje s KV+ za vzniku veľkého komplexu zlúčenín medzi kryštálovou violeťou a jódom (komplex zlúčenín CV-I) vo vnútornej a vonkajšej vrstve bunky. Tento komplex zlúčenín si zachová fialovú farbu kryštálovej fialky vo vnútri bunky, na zafarbených miestach.
Jód je žieravá látka. Zabráňte vdýchnutiu, požitiu alebo kontaktu s pokožkou
Krok 4. Pridajte farebné bielidlo a potom rýchlo opláchnite
Na tento dôležitý krok sa zvyčajne používa zmes acetónu a etanolu v pomere 1: 1, ktorý je potrebné starostlivo načasovať. Umiestnite sklíčko pod určitým uhlom a potom pridajte farebné bielidlo, až kým vo vode použitej na oplachovanie už nie je viditeľný purpur. Ak bielidlo obsahuje vysokú koncentráciu acetónu, obvykle to trvá menej ako 10 sekúnd alebo dokonca kratší čas. Tento krok okamžite zastavte, inak sa z farbiva tiež vylúhujú kryštálovo fialové z grampozitívnych a negatívnych buniek a postup farbenia sa musí zopakovať. Prebytočné farebné bielidlo okamžite opláchnite predchádzajúcou technikou.
- Ako náhrada môže byť použitý čistý acetón (95%+). Čím viac acetónu použijete, tým rýchlejšie bude bielidlo pôsobiť, takže musíte venovať väčšiu pozornosť načasovaniu.
- Ak máte problém so sledovaním času tohto kroku, pridajte po kvapkách bielidlo.
Krok 5. Posypte farbivo proti farbivom a potom opláchnite
Protiškvrna, zvyčajne safranín alebo fuchsín, sa používa na zvýšenie kontrastu medzi gramnegatívnymi a grampozitívnymi baktériami zafarbením odfarbených (odfarbených) baktérií, t.j. gramnegatívnych baktérií, na ružovo alebo na červeno. Nechajte pôsobiť najmenej 45 sekúnd, potom opláchnite.
Fuchsin bude intenzívne farbiť mnohé gramnegatívne baktérie, ako napríklad Haemophilus spp a Legionella spp. Táto metóda je vhodná pre začiatočníkov
Krok 6. Sklíčko osušte
Môžete ich vysušiť na čerstvom vzduchu, aby ste ich vysušili, alebo ich môžete vysušiť pomocou biblického papiera, ktorý sa predáva na tento účel. Gramov postup farbenia je dokončený.
Metóda 3 z 3: Kontrola výsledkov farbenia
Krok 1. Pripravte si svetelný mikroskop
Uložte sklíčko pod mikroskop. Baktérie sa veľmi líšia veľkosťou, takže celkové požadované zväčšenie sa bude líšiť od 400x do 1000x. Na dosiahnutie ostrejšieho obrazu sa odporúča použiť objektív s ponorným olejom. Na sklíčko nakvapkajte ponorný olej a pri kvapkaní sa vyhýbajte pohybu, aby sa nevytvorili bubliny. Posuňte rukoväť šošovky mikroskopu tak, aby šošovka objektívu zapadla na svoje miesto a dotkla sa oleja.
Olejový ponor je možné použiť iba na špeciálne navrhnuté šošovky, nie na „suché“šošovky
Krok 2. Skúste identifikovať grampozitívne a gramnegatívne baktérie
Sklíčko preskúmajte pod svetelným mikroskopom. Grampozitívne baktérie majú purpurovú farbu, pretože kryštálová fialka je zachytená v hrubej bunkovej stene. Gramnegatívne baktérie budú mať ružovú alebo červenú farbu, pretože kryštálovú fialku prepláchnete cez tenké bunkové steny, kam vstúpi ružové protifarbivo.
- Ak je vzorka príliš hrubá, výsledok môže byť falošne pozitívny. Zafarbite novú vzorku, ak ukazuje všetky grampozitívne baktérie, aby ste sa presvedčili, že výsledok je správny.
- Ak použijete príliš veľa farebného bielidla, výsledok môže byť falošne negatívny. Zafarbite novú vzorku, ak ukazuje všetky gramnegatívne baktérie, aby ste sa presvedčili, že výsledok je správny.
Krok 3. Porovnajte výsledky, ktoré vidíte, s referenčným obrázkom
Ak neviete, ako baktérie vyzerajú, preštudujte si zbierku referenčných snímok, zvyčajne zoradených podľa tvaru a gramových škvŕn. Online databázy si môžete prezerať aj na [národnej databáze mikrobiálnych patogénov, baktériách vo fotografiách a na mnohých ďalších online stránkach. Aby sa uľahčila identifikácia, nižšie sú uvedené príklady baktérií, s ktorými sa bežne stretávame alebo sú dôležité pre diagnostiku, klasifikované podľa ich gramového stavu a tvaru.
Krok 4. Identifikujte grampozitívne baktérie na základe ich tvaru
Baktérie sú ďalej klasifikované podľa tvaru pod mikroskopom, najčastejšie ako koky (sférické) alebo tyčinky (valcovité). Tu je niekoľko príkladov grampozitívnych baktérií (purpurovej farby) podľa ich tvaru:
- Grampozitívne koky zvyčajne stafylokoky (čo znamená skupinové koky) alebo streptokoky (čo znamená reťazové koky).
- Grampozitívne tyčinky, ako sú Bacillus, Clostridium, Corynebacterium a Listeria. Tyčinkové baktérie Actinomyces spp. zvyčajne majú vetvy alebo vlákna.
Krok 5. Identifikujte gramnegatívne baktérie
Gramnegatívne baktérie (ružovej farby) sú často klasifikované do troch skupín. Cocci sú guľovitého tvaru, tyčinky sú dlhé a tenké, zatiaľ čo cocoidové tyčinky sú medzi nimi.
- Gram negatívne koky Najbežnejšou je Neisseria spp.
- Gramnegatívne tyčinky napríklad E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas a mnoho ďalších. Vibrio cholerae možno vnímať ako pravidelný alebo ohnutý kmeň.
- Gramnegatívne tyčinkové baktérie „coccoid“(alebo „coccobacilli“) napríklad Bordetella, Brucella, Haemophilus a Pasteurella
Krok 6. Starostlivo skontrolujte, či sú výsledky zmiešané
Niektoré baktérie je ťažké presne sfarbiť kvôli krehkosti alebo voskovitému charakteru ich bunkových stien. Tieto baktérie môžu vykazovať zmes purpurovej alebo ružovej v tej istej bunke alebo medzi rôznymi bunkami v rovnakom nátere. Bakteriálne vzorky staršie ako 24 hodín môžu tento problém vykazovať, ale existujú aj niektoré bakteriálne druhy, ktorých farbenie je v akomkoľvek veku odberu vzoriek ťažké. Tieto baktérie vyžadujú na identifikáciu špecializovanejšie testy, ako napríklad kyslé rýchle farbenie, pozorovanie v bakteriálnej kultúre, kultivačné médium TSI alebo genetické testovanie.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium a Propionibacterium spp. všetky sú grampozitívne baktérie, ale často nie sú jasne zafarbené.
- Malé, štíhle baktérie, ako sú Treponema, Chlamydia a Rickettsia spp. ťažko sa farbí gramovou metódou.
Krok 7. Zlikvidujte všetok zostávajúci spotrebný materiál a vybavenie
Tento postup likvidácie odpadu sa medzi laboratóriami líši a závisí od použitých materiálov. Kvapalina v zafarbovacom tácku sa spravidla likviduje vo fľašiach označených ako nebezpečný odpad. Sklíčka namočte do 10% roztoku bielidla a potom zlikvidujte v nádobe na ostré predmety.
Tipy
- Nezabudnite, že výsledky Gramovho farbenia budú dobré iba vtedy, ak je vzorka dobrá. Je dôležité informovať pacientov, aby mohli poskytnúť dobrú vzorku (napr. Rozdiel medzi pľuvaním a hlbokým kašľom na získanie vzorky sputa).
- Ako farebné bielidlo reaguje etanol pomalšie ako acetón.
- Na zaistenie bezpečnosti dodržiavajte štandardné laboratórne predpisy.
- Na cvičenie používajte tampón na tvár, pretože obsahuje grampozitívne aj gramnegatívne baktérie. Ak vidíte iba jeden druh baktérií, možno používate príliš málo alebo príliš veľa bielidla.
- Na zaistenie šmykľavky môžete použiť drevené spony.
Pozor
- Acetón a etanol sú horľavé látky. Acetón odstráni olej z vašich rúk, vďaka čomu bude vaša pokožka ľahšie absorbovať ďalšie chemikálie. Noste rukavice a používajte ich opatrne.
- Nenechajte náter zaschnúť, kým nevyperiete Gramovu škvrnu alebo kontrastné farbenie.
Čo potrebuješ
- Ukážka siete
- Sklenená šmýkačka
- Pipeta
- Malý zdroj ohňa alebo posuvný ohrievač alebo metanol
- Voda
- Kryštálová fialka
- Jód
- Farebné bielidlo, ako je alkohol alebo acetón
- Safranín
